Γενετική Διαφοροποίηση Εγχώριων Ποικιλιών και Πληθυσμών Σκόρδου Allium sativum L. Χρησιμοποιώντας την Τεχνική HRM-barcoding

Abstract

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας έγινε χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) για την μελέτη και σύγκριση 35 πληθυσμών σκόρδου (Allium sativum). Τα δεδομένα που συγκρίθηκαν αφορούσαν κυρίως τα χαρακτηριστικά των ποικιλιών, το DNA, καθώς και την διαφορά που παρουσιάζουν στο φθορισμό μεταξύ τους. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε είναι διαδικασία ενίσχυσης μιας DNA αλληλουχίας με τη μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης(Polymerase Chain Reaction-PCR) και ταυτόχρονα της ανίχνευσης του παραγόμενου προϊόντος σε πραγματικό χρόνο καθ’ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης (Real-time PCR), μέσω της χρήσης ειδικών φθοριζόντων χρωστικών που ενσωματώνονται στην αλληλουχία που ενισχύεται. Η Real Time PCR αναφέρεται στη μεγέθυνση DNA με PCR που ελέγχεται ενώ συμβαίνει η μεγέθυνση. Η real-time PCR στον πραγματικό χρόνο είναι μία ποσοτική αντίδραση PCR κατά την οποία η μεγέθυνση του DNA στόχου και η ανίχνευση του προϊόντος γίνονται ταυτόχρονα στο ίδιο σωληνάριο, διότι το προϊόν που παράγεται συνδέεται με φθορίζουσα χρωστική που ανιχνεύεται από το οπτικό σύστημα του ειδικού κυκλοποιητή που χρησιμοποιείται στη real-time PCR. Με το όργανο αυτό καταγράφεται η κινητική της μεγέθυνσης του DNA από την ένταση του σήματος του φθορισμού που αντανακλά το ποσό του συντιθέμενου νέου DNA. Έτσι μπορεί να μετρηθεί επακριβώς το ποσό του DNA. Η επιτυχία ενός πειράματος PCR εξαρτάται κυρίως από τη σχεδίαση των εκκινητών. Οι εκκινητές (Primers) είναι ολιγονουκλεοτίδια που οριοθετούν το τμήμα DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Ο σωστός σχεδιασμός των εκκινητών επηρεάζει σημαντικά το αποτέλεσμα της PCR. Οι πληθυσμοί που μελετήθηκαν είναι κατά κύριο λόγο ελληνικής προέλευσης αλλά υπάρχουν και ισπανικής και κινέζικης προέλευσης. Όλες οι ποικιλίες που μελετήθηκαν καλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν στον ίδιο αγρό με τις ίδιες συνθήκες ανάπτυξης και τις ίδιες καλλιεργητικές φροντίδες. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να βρεθούν οι διαφορές που υπάρχουν σε αυτούς τους πληθυσμούς όσον αφορά τα χαρακτηριστικά τους, τη διαφορά που παρουσιάζουν στο φθορισμό και την αντίδραση τους στις δόκιμες με διαφορετικούς χλωροπλαστικούς primers τύπου ccmp